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Apr 03, 2024

Diagnóstico de tuberculosis genitourinaria: detección de lipoarabinomanano micobacteriano y MPT

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 11560 (2023) Citar este artículo 405 Accesos 1 Altmetric Detalles de métricas Detectamos un cóctel de lipoarabinomanano (LAM) de Mycobacterium tuberculosis y

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11560 (2023) Citar este artículo

405 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

Detectamos un cóctel de lipoarabinomanano (LAM) de Mycobacterium tuberculosis y biomarcadores MPT-64 dentro de vesículas extracelulares (EV) en orina de pacientes con tuberculosis genitourinaria (GUTB) mediante un ensayo de inmuno-PCR de base nanométrica (I-PCR), es decir, acoplado a perlas magnéticas. I-PCR basada en nanopartículas de oro (MB-AuNP-I-PCR) y comparó los resultados con I-PCR y Magneto-ELISA. El tamaño de los vehículos eléctricos en orina osciló entre 52,6 y 220,4 nm según lo analizado mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y análisis de seguimiento de nanopartículas. Las AuNP funcionalizadas (junto con anticuerpos/oligonucleótidos de detección) se caracterizaron mediante espectroscopia UV-vis, TEM, ELISA, PCR, microscopía de fuerza atómica y espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier, mientras que la conjugación de anticuerpos de captura con MB se validó mediante espectroscopia UV-vis y magneto- ELISA. Nuestro MB-AuNP-I-PCR exhibió sensibilidades del 85 % y 87,2 % en casos clínicamente sospechosos (n = 40) y totales (n = 47) de TBGU, respectivamente, con una especificidad del 97,1 % en controles sin TB (n = 35). . Estos resultados fueron autenticados aún más mediante la I-PCR cuantitativa SYBR Green MB-AuNP en tiempo real (MB-AuNP-RT-I-PCR). Al mismo tiempo, I-PCR y Magneto-ELISA mostraron sensibilidades de 68,1% y 61,7%, respectivamente, en el total de casos de GUTB, que fueron significativamente más bajas (p <0,05-0,01) que MB-AuNP-I-PCR. Sorprendentemente, SYBR Green MB-AuNP-RT-I-PCR cuantificó un amplio rango (400 fg/mL – 11 ng/mL) de LAM+MPT-64 dentro de los vehículos eléctricos en orina de casos de GUTB mediante SYBR Green MB-AuNP-RT-I-PCR, que puede evaluar la dinámica de la enfermedad. Sin duda, este estudio mejorará los algoritmos actuales utilizados en el diagnóstico de GUTB.

Antes de la pandemia de COVID-19, la tuberculosis (TB) era la principal causa de muerte por un solo agente infeccioso, ubicándose por encima del VIH/SIDA, pero ahora la tuberculosis es la segunda causa de muerte infecciosa después de la COVID-191. En 2021, se notificaron aproximadamente 1,4 millones y 0,19 millones de muertes entre personas infectadas con tuberculosis VIH negativas y VIH positivas, respectivamente1. La pandemia de COVID-19 tuvo un impacto negativo en el acceso al diagnóstico y tratamiento de la tuberculosis y en la carga general de tuberculosis1. En 2021, India representó la mayor carga de tuberculosis (28%), seguida de Indonesia (9,2%) y China (7,4%)1. La tuberculosis genitourinaria (GUTB) es la segunda forma más notificada de tuberculosis extrapulmonar (EPTB) en los países en desarrollo. como India y la tercera forma extendida en países de baja endemia2. Las presentaciones clínicas inusuales, la localización de la enfermedad en diversos sitios anatómicos y la naturaleza paucibacilar de las muestras hacen que el diagnóstico de TBGU masculino/femenino sea un desafío preocupante. Para reducir la morbilidad/mortalidad asociada con la TBGU, se requiere de inmediato un diagnóstico rápido y preciso. En los países en desarrollo, la baciloscopia se utiliza ampliamente pero carece de sensibilidad y reproducibilidad3. Aunque la identificación por cultivo de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) a partir de biopsias endometriales (EB)/muestras de orina de casos de GUTB se considera el estándar de referencia/oro, generalmente muestra una baja sensibilidad en el medio Lowenstein-Jensen (LJ) debido a la escasa carga bacteriana dentro ellos4,5. Mientras tanto, tiene un largo tiempo de entrega de 4 a 6 semanas y necesita la experiencia de técnicos capacitados5. El examen histopatológico (HPE) es una técnica importante para diagnosticar GUTB5, aunque el HPE no es patognomónico excepto por la presencia de bacterias acidorresistentes (BAAR), ya que no puede diferenciar entre GUTB y otras enfermedades granulomatosas6,7. Cabe destacar que la ecografía, la tomografía computarizada y la urografía intravenosa son las principales modalidades de imagen empleadas para el diagnóstico de TBGU tanto masculina como femenina, mientras que la laparoscopia y la histerosalpingografía se utilizan principalmente para diagnosticar la TBGU femenina4,8; sin embargo, ninguna técnica de imagen por sí sola es adecuada para un diagnóstico definitivo.

Es de destacar que es tedioso recolectar muestras de GUTB, por ejemplo, biopsias de próstata/riñón y EB, ya que implican un procedimiento invasivo riguroso, valdría la pena explorar muestras de fácil acceso, como orina, plasma/suero, etc.4. 6. La principal ventaja de recolectar orina sobre otros biofluidos es que está fácilmente disponible en grandes cantidades y se obtiene de manera no invasiva9. Sin embargo, la concentración de diversos biomarcadores y componentes bioquímicos en la orina es bastante variable y de naturaleza dinámica debido a la diferente ingesta de líquidos, el momento de la recolección de la muestra, la edad y el diferente estado de salud de los individuos9.

Las vesículas extracelulares (VE), las biopsias líquidas unidas a membranas, están presentes en diversos fluidos corporales, incluidos la orina, el suero y el líquido pleural/ascítico10,11. Los tres tipos principales de VE (las nanoestructuras) son las microvesículas (MV), los exosomas y los cuerpos apoptóticos que se diferencian en función de su biogénesis, tamaño y función12. Notablemente, los exosomas (30-150 nm) o vesículas intraluminales surgen de una ruta endosómica, las MV (100 nm-1 µm) se forman pellizcando o dirigiendo la gemación hacia afuera de la membrana plasmática de la célula, y se liberan cuerpos apoptóticos (50-5000 nm). por células moribundas en el espacio extracelular11,12,13. Dado que la orina pura contiene una baja concentración de biomarcadores de Mtb, los vehículos eléctricos aislados de muestras de orina de pacientes con tuberculosis pueden concentrar esos biomarcadores y eliminar los contaminantes, lo que conduce a un mejor rendimiento cuando se evalúan mediante un método sensible, por ejemplo, inmuno-PCR (I-PCR). )14. Detectamos lipoarabinomanano (LAM) y CFP-10 (Rv3874) individuales en vehículos eléctricos de orina de pacientes con tuberculosis mediante I-PCR que mostró superioridad sobre ELISA14; La detección de LAM mediante I-PCR reveló una mejor sensibilidad que la detección de CFP-10, aunque estos biomarcadores no se evaluaron en pacientes con GUTB.

Además, se identificó un cóctel de biomarcadores Mtb MPT-64 (Rv1980c) y CFP-10 en pacientes con tuberculosis mediante un ensayo I-PCR de base nanométrica, a saber. I-PCR basada en nanopartículas de oro acopladas a perlas magnéticas (MB-AuNP-I-PCR) con resultados alentadores15, aunque no se evaluaron muestras exclusivas de GUTB mediante este método. Sorprendentemente, la utilidad de MB (para acoplar anticuerpos de captura) y AuNP funcionalizadas (conjugadas con anticuerpos/oligonucleótidos de detección) en MB-AuNP-I-PCR permite la unión homogénea de anticuerpos a los antígenos objetivo en el sistema líquido, lo que garantiza una disminución de las señales de fondo como así como el efecto de matriz de muestra16,17. También detectamos un cóctel de MPT-64 y ESAT-6 (Rv3875) en muestras clínicas (EB y orina) de pacientes con GUTB mediante I-PCR con sensibilidad/especificidad moderada5. Al mismo tiempo, LAM y MPT-64 se contemplan como posibles biomarcadores para diagnosticar la tuberculosis activa en orina/VEV en orina5,14,18. Para mejorar aún más la precisión diagnóstica de I-PCR, en este estudio intentamos detectar un cóctel de LAM+MPT-64 en EV urinarios de pacientes con GUTB mediante MB-AuNP-I-PCR y esos resultados se compararon directamente con I. -Ensayos PCR y Magneto-ELISA. Además, validamos nuestros resultados de MB-AuNP-I-PCR con el ensayo cuantitativo SYBR Green MB-AuNP-I-PCR en tiempo real (MB-AuNP-RT-I-PCR).

En un estudio preliminar, entre 10 muestras de orina de casos clínicamente sospechosos de GUTB, se encontró que 6, 5 y 3 casos fueron positivos para la detección de LAM+MPT-64 mediante MB-AuNP-I-PCR, I-PCR y Magneto-ELISA. respectivamente. Por lo tanto, se intentó mejorar la sensibilidad de MB-AuNP-I-PCR detectando LAM+MPT-64 en las EV de orina de pacientes con GUTB. Antes de esto, los vehículos eléctricos en orina se caracterizaban mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA).

Las micrografías TEM de vehículos eléctricos en orina de casos de GUTB mostraron que su tamaño variaba entre 52,6 y 184 nm, mientras que el tamaño de los vehículos eléctricos en orina de controles sanos variaba de 79,4 a 137 nm (Fig. 1a, b). Sin embargo, en este estudio, el tamaño medio de partículas de los vehículos eléctricos en la orina de los casos de TBGU osciló entre 203 ± 81,8 y 220,4 ± 84 nm mediante la técnica NTA.

Imágenes TEM que muestran (a) el tamaño de los EV en orina aislados de pacientes con GUTB, (b) el tamaño de los EV en orina aislados de controles sanos y (c) el tamaño de AuNP de ~ 20 nm.

Se observó un único pico a 524,2 nm para las AuNP mediante espectroscopia UV-vis (Figura 1a complementaria), mientras que las imágenes TEM revelaron que las AuNP eran esféricas con un tamaño promedio de ~ 20 nm (Figura 1c). Además, el número de moléculas de ADN señal unidas por AuNP en las AuNP funcionalizadas se determinó mediante espectrofotometría de fluorescencia. Primero, se trazó una curva estándar entre la intensidad de la fluorescencia frente a diferentes concentraciones de ADN señal marcado con amidita con fluoresceína (ADN señal FAM) (que van de 0,5 a 2 fmol/μL) (Fig. 2). Las réplicas de los valores de 'intensidad media de fluorescencia' para cada punto de referencia de este gráfico de dos experimentos independientes se muestran en la Tabla complementaria 1. Se encontró que la concentración de la señal de ADN liberada en las AuNP funcionalizadas era 1,17 fmol/μL, lo que arrojó 0,468 pmol/μL después de multiplicar con un factor de dilución de 1:400 y dio como resultado 73,3 moléculas de ADN señal por AuNP en las AuNP funcionalizadas.

Se trazó una curva estándar entre la intensidad de fluorescencia frente a diferentes concentraciones (de 0,5 a 2 fmol/μl) de ADN de señal FAM. Se encontró que la ecuación de regresión era y = 36,91x+12,75. Los valores medios de intensidad de fluorescencia se derivaron de dos réplicas en el gráfico. Cada punto de referencia representa el valor medio de dos experimentos independientes realizados por duplicado.

Las AuNP funcionalizadas junto con anticuerpos de detección y oligonucleótidos se caracterizaron mediante espectroscopia UV-vis, ELISA, PCR, TEM, microscopía de fuerza atómica (AFM) y espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR). En particular, las AuNP funcionalizadas mostraron un cambio en el pico máximo de absorbancia de las AuNP no unidas de 524,2 a 533,8 nm mediante espectroscopia UV-vis (Figura complementaria 1b), validando así la conjugación de anticuerpos de detección y oligonucleótidos con AuNP. Además, la conjugación de los anticuerpos de detección con las AuNP se confirmó mediante ELISA (Figura 2a complementaria), en la que las AuNP funcionalizadas (que contienen anticuerpos de detección) mostraron una densidad óptica media (DO) significativamente mayor (p <0,001), en comparación con las AuNP no unidas. Al mismo tiempo, la conjugación del ADN señal con las AuNP funcionalizadas se validó mediante PCR convencional (Figura complementaria 2b), donde se observó una banda específica de 76 pb.

La espectroscopía FTIR detectó cambios en bandas típicas de AuNP conjugadas con anticuerpos de detección y AuNP funcionalizadas. Los espectros FTIR antes y después de la funcionalización de las AuNP se representan en la Fig. 3, donde se observó una banda de 3300–3600 cm-1 debido al estiramiento O – H / N – H en AuNP, AuNP + anticuerpos de detección y AuNP funcionalizadas. Sin embargo, se observó un ensanchamiento de la misma banda en las AuNP funcionalizadas (línea verde), en comparación con las AuNP (línea azul) y las AuNP + anticuerpos de detección (línea naranja), lo que sugiere la estabilización de las AuNP mediante la funcionalización mediante la descomposición de O-H. Enlaces /N–H. Otra banda característica (correspondiente al estiramiento de CH) a 2911 cm-1 y 2982 cm-1 se observó en las AuNP y AuNP + anticuerpos de detección, respectivamente, que aunque faltaba en las AuNP funcionalizadas, ya que se deformó después de la funcionalización con anticuerpos de detección/ oligonucleótidos. Además, las bandas en AuNP y AuNP + anticuerpos de detección a 1643 cm-1 y 1386 cm-1 indicaron un estiramiento asimétrico y simétrico de las vibraciones de flexión C = O, que fue menos intenso en las AuNP funcionalizadas. La mayoría de las bandas desaparecieron para las AuNP entre 1000 y 1500 cm-1 después de la funcionalización. Sin embargo, se observó un cambio de banda de 1088 a 1092 cm-1 después de la funcionalización de las AuNP. Los cambios en las bandas observados en los espectros FTIR confirmaron la conjugación estable de las AuNP con anticuerpos de detección, así como en las AuNP funcionalizadas.

Espectros FTIR de: AuNPs (línea azul), AuNPs conjugadas con anticuerpos policlonales 'conejo anti-LAM+anti-MPT-64' (pAbs, anticuerpos de detección) (línea naranja) y AuNPs funcionalizadas (conjugadas con anticuerpos de detección y oligonucleótidos) (verde línea).

La topografía 3D de AuNP, AuNP + anticuerpos de detección y AuNP funcionalizadas se representan en las figuras 4a a c (recuadro i). Curiosamente, las imágenes de AFM revelaron una distribución de altura que oscilaba entre 15 y 35 nm para las AuNP (Fig. 4a recuadro ii) y una altura media de 40 nm para las AuNP + anticuerpos de detección (Fig. 4b recuadro ii). Al mismo tiempo, la altura media se incrementó a 70 nm para las AuNP funcionalizadas (Fig. 4c recuadro ii). Es de destacar que un aumento en la altura de las AuNP después de la conjugación con anticuerpos de detección y la funcionalización indicó la formación y agregación de partículas más grandes.

Imágenes de AFM que muestran (a) AuNP donde el recuadro (i) representa la topografía 3D y el recuadro (ii) representa la distribución de altura, (b) AuNP conjugadas con pAb 'conejo anti-LAM + anti-MPT-64' donde el recuadro (i) representa 3D la topografía y el recuadro (ii) representan la distribución de altura, mientras que (c) AuNP funcionalizadas donde el recuadro (i) representa la topografía 3D y el recuadro (ii) representa la distribución de altura.

El acoplamiento de anticuerpos de captura, es decir, pAb anti-Mtb de cobaya con MB, se confirmó tomando OD a 405 nm con Magneto-ELISA, que mostró una OD media significativamente mayor (p <0,001) que los MB no unidos (Figura complementaria 3a). Además, la conjugación de anticuerpos de captura con MB se validó de forma cruzada mediante espectroscopia UV-vis a 270 nm, que mostró una DO media significativamente mayor (p <0,001), en comparación con los MB no unidos (Figura complementaria 3b).

Las representaciones esquemáticas para MB-AuNP-I-PCR/MB-AuNP-RT-I-PCR e I-PCR/Magneto-ELISA se representan en las figuras complementarias 4a, b, respectivamente. Obtuvimos un LOD de 1 fg / ml para Mtb LAM + MPT-64 purificado (en tampón) mediante MB-AuNP-I-PCR e I-PCR (Fig. 5a, b). Curiosamente, cuando los EV de orina de individuos sanos (n = 5) se agregaron con LAM+MPT-64 purificado, MB-AuNP-I-PCR obtuvo un LOD similar de 1 fg/mL, lo que no infiere ningún efecto de matriz de muestra, mientras que La I-PCR mostró un LOD más alto de 10 fg/ml (datos no mostrados), lo que infiere la presencia de un efecto de matriz de muestra. Los valores del ciclo umbral (Ct) se determinaron estableciendo la fluorescencia en la fase exponencial de las curvas de amplificación para SYBR Green MB-AuNP-RT-I-PCR. La curva estándar se trazó entre los valores de Ct frente a las concentraciones logarítmicas de LAM+MPT-64 purificada (Fig. 6a), donde se encontró que el rango de detección final de LAM+MPT-64 era 100 fg/mL – 10 ng/mL por MB-AuNP-RT-I-PCR con un LOD de 45 fg/ml. Por el contrario, Magneto-ELISA mostró un rango de detección final entre 100 pg/ml y 1 µg/ml con un LOD de 100 pg/ml (Fig. 6a). Las réplicas de los valores medios de Ct y OD para cada punto de referencia de este gráfico de dos experimentos independientes se presentan en la Tabla complementaria 2. Además, MB-AuNP-RT-I-obtuvo LOD de 60 fg/mL y 400 pg/mL. PCR y Magneto-ELISA, respectivamente, dentro de EV urinarios (de un individuo sano) enriquecidos con LAM + MPT-64 purificado (Figura complementaria 5), ​​lo que implica un efecto de matriz de muestra marginal con MB-AuNP-RT-I-PCR. en comparación con Magneto-ELISA.

(a) Determinación de LOD para Mtb LAM+MPT-64 purificado mediante el ensayo MB-AuNP-I-PCR, en el que un amplicón de 76 pb indicó una prueba positiva en gel de agarosa al 4%: Carril M, escalera de 20 pb; carriles 1 a 12, diluciones seriadas diez veces del LAM+MPT-64 purificado (de 1 µg/ml a 10 ag/ml); carril 13, control negativo para I-PCR (sin recubrimiento de antígeno, se añaden todos los reactivos); carril 14, control negativo para PCR (sin ADN molde); carril 15, control positivo de PCR (señal de ADN, 1 ng/ml). Los experimentos se realizaron tres veces y se muestra una de las figuras representativas. (b) determinación de LOD para Mtb LAM+MPT-64 purificado mediante ensayo de I-PCR, donde un amplicón de 470 pb indicó una prueba positiva en gel de agarosa al 2%: Carril M, escalera de 100 pb; carriles 1 a 12, diluciones seriadas diez veces del LAM+MPT-64 purificado (de 1 µg/ml a 10 ag/ml); carril 13, control negativo para I-PCR (sin recubrimiento de antígeno, se añaden todos los reactivos); carril 14, control negativo para PCR (sin ADN molde); y carril 15, control positivo para PCR (ADN biotinilado indicador, 1 ng/ml). Los experimentos se realizaron tres veces y se muestra una de las figuras representativas.

(a) La(s) curva(s) estándar para LAM+MPT-64 purificada mediante MB-AuNP-RT-I-PCR (de 100 fg/mL a 10 ng/mL) y Magneto-ELISA (de 100 pg/mL a 1 µg/mL): se encontró que un coeficiente de correlación era 0,928 para MB-AuNP-RT-I-PCR y la ecuación de regresión correspondiente fue Ct = − 1,11 × ln (conc.)+28,84. Los valores medios de Ct (para MB-AuNP-RT-I-PCR) y OD (para Magneto-ELISA) se derivaron de dos réplicas. Cada punto de referencia representa el valor medio de dos experimentos independientes realizados por duplicado. (b). Diagrama de dispersión para MB-AuNP-RT-I-PCR y Magneto-ELISA, en el que se observó mayor variabilidad [coeficiente de variación (CV) de 80,6 frente a 50,9 %] en la concentración de LAM+MPT-64 para MB-AuNP-RT -I-PCR, comparado con Magneto-ELISA. Las líneas horizontales negras indican el valor mediano tanto para MB-AuNP-RT-I-PCR como para Magneto-ELISA.

Alcanzamos sensibilidades del 100% [intervalo de confianza (IC) del 95%: 59-100%] y del 85% (IC del 95%: 70,2-94,3%) mediante MB-AuNP-I-PCR en EV de orina de siete GUTB confirmados y 40 clínicamente sospechosos. pacientes, respectivamente (Tabla 1), frente al estándar de referencia compuesto (CRS) [una combinación de características clínicas, imágenes, frotis/cultivo, GeneXpert, IS6110 PCR y respuesta a la terapia antituberculosa (ATT)]. Sorprendentemente, MB-AuNP-I-PCR reveló sensibilidades significativamente más altas (p <0,05–0,01) que I-PCR/Magneto-ELISA tanto en casos clínicamente sospechosos como en casos totales de GUTB. Entre 35 controles sin tuberculosis, solo uno y tres casos mostraron resultados falsos positivos, lo que demuestra especificidades del 97,1 % (IC del 95 %: 85,1–99,9 %) y del 91,4 % (IC del 95 %: 76,9–98,2 %) según MB-AuNP-I -PCR e I-PCR/Magneto-ELISA, respectivamente (Tabla 1). En la figura complementaria 6 se representan ejemplos representativos de casos de GUTB y controles sin tuberculosis evaluados mediante MB-AuNP-I-PCR según la detección de LAM + MPT-64 en vehículos eléctricos en orina.

En particular, MB-AuNP-RT-I-PCR detectó un amplio rango de 400 fg/mL–11 ng/mL de concentración de LAM+MPT-64 dentro de los EV urinarios de casos de GUTB, mientras que un rango estrecho (2–11 ng /mL) del mismo fue detectado por Magneto-ELISA. Para determinar la variabilidad de las observaciones, se dibujaron diagramas de dispersión de MB-AuNP-RT-I-PCR y Magneto-ELISA (Fig. 6b), en los que se alcanzó un coeficiente de variación (CV) más alto para MB-AuNP-RT- I-PCR, en comparación con Magneto-ELISA (80,6 frente a 50,9%), lo que demuestra la detección de un rango más amplio de concentraciones de LAM+MPT-64 en EV urinarias de pacientes con GUTB mediante MB-AuNP-RT-I-PCR que Magneto- ELISA. Posteriormente, el valor medio de Ct y OD (de dos réplicas) obtenidos para cada paciente mediante MB-AuNP-RT-I-PCR cuantitativa y Magneto-ELISA se muestran en la Tabla 2. Para MB-AuNP-RT-I-PCR, los valores medios de Ct inferiores a NC+3SD (26,20) se consideraron positivos para casos de TBGU, mientras que los valores superiores a 26,20 se consideraron sujetos sin TB. Al mismo tiempo, los valores medios de DO superiores a la "OD media del grupo de control sin tuberculosis + 2 DE" (0,189) se consideraron positivos para los casos de TBGU mediante Magneto-ELISA, mientras que los valores inferiores a 0,189 se consideraron sujetos sin tuberculosis. Esto mostró una sensibilidad del 85,7 % (IC del 95 %: 63,7–96,9 %) y una especificidad del 95 % (IC del 95 %: 75,1–99,9 %) mediante MB-AuNP-RT-I-PCR en 21 casos clínicamente sospechosos de TBGU y 20 casos sin sospecha clínica. -Controles de TB, respectivamente (Tabla 3), que fueron comparables a los resultados de MB-AuNP-I-PCR.

El diagnóstico de GUTB es un desafío desalentador. En este estudio, detectamos un cóctel de biomarcadores Mtb LAM y MPT-64 en los vehículos eléctricos en orina de pacientes con GUTB mediante el ensayo MB-AuNP-I-PCR. Utilizamos el 'reactivo de aislamiento de exosoma total' para aislar vehículos eléctricos en orina de casos de GUTB, como se empleó en un estudio anterior14. Los vehículos eléctricos en orina generalmente se aíslan mediante ultracentrifugación y centrifugación en gradiente de sacarosa19,20; sin embargo, estos métodos tienen un tiempo de respuesta prolongado y proporcionan un bajo rendimiento de vehículos eléctricos. Las micrografías TEM de vehículos eléctricos en orina de pacientes con GUTB y controles sanos mostraron su tamaño entre 52,6 y 184 nm (Fig. 1a, b). Este hallazgo concuerda con un informe anterior21, en el que el tamaño de los vehículos eléctricos en la orina de pacientes con cáncer de próstata y controles sanos (aislados mediante centrifugación de alta velocidad) oscilaba entre 20 y 230 nm, según lo revelado por TEM. Al mismo tiempo, en este estudio, el tamaño medio de partículas de los vehículos eléctricos en orina de pacientes con TBGU evaluados mediante la técnica NTA osciló entre 203 ± 81,8 y 220,4 ± 84 nm. Sin embargo, NTA tiene varias limitaciones, ya que requiere un entorno libre de vibraciones y un análisis de muestras menos viscosas22, aunque evaluamos el tamaño de los vehículos eléctricos en orina mediante análisis NTA y TEM.

Además, mediante TEM (Fig. 1c) se observaron AuNP ligeramente polidispersas y esféricas de ~ 20 nm, que posteriormente se funcionalizaron con pAb (anticuerpos de detección) y oligonucleótidos 'conejo anti-LAM + MPT-64'. Esto resultó en un desplazamiento al rojo de 524,2 nm (correspondiente a una banda de resonancia de plasmón superficial característica de AuNP) a 533,8 nm en el espectro UV-vis, lo que confirma la conjugación de anticuerpos de detección/oligonucleótidos con AuNP (Figura complementaria 1b). Este hallazgo está de acuerdo con informes anteriores sobre la caracterización espectroscópica UV-vis de AuNP funcionalizadas para detectar proteínas Mtb ESAT-6 y CFP-10 purificadas mediante ensayos AuNP-RT-I-PCR/MB-AuNP-I-PCR17,23. 24. Mientras detectaban la interleucina-3 y el factor de células madre mediante AuNP-RT-I-PCR, Potuckova et al.25 documentaron un cambio de 5 a 10 nm en la longitud de onda cuando las AuNP se conjugaban con anticuerpos/oligonucleótidos de detección. En particular, se determinó que el número de moléculas de ADN de señal unidas por AuNP de 20 nm era ~ 73 moléculas/AuNP en las AuNP funcionalizadas (Fig. 2), lo que coincide con los informes anteriores26,27, en los que entre 75 y 100 moléculas de señal El ADN se unió por AuNP de 30 nm de tamaño.

La conjugación de anticuerpos 'anti-LAM+MPT-64' con las AuNP funcionalizadas también se confirmó mediante ELISA (Figura 2a complementaria), donde se observó una DO significativamente mayor (p <0,001) para las AuNP funcionalizadas, en comparación con las AuNP no unidas. . Mientras tanto, las AuNP funcionalizadas revelaron un amplicón de 76 pb mediante PCR (Figura complementaria 2b), lo que validó la conjugación del ADN señal con las AuNP funcionalizadas. Del mismo modo, mientras se detectaban Mtb CFP-10 y CFP-10+MPT-64 purificadas mediante AuNP-RT-I-PCR/MB-AuNP-I-PCR, la unión de los anticuerpos de detección y los oligonucleótidos a las AuNP funcionalizadas se confirmó mediante ELISA y PCR. , respectivamente15,23.

Se utilizó espectroscopía FTIR para caracterizar las AuNP funcionalizadas en el presente estudio (Fig. 3), en el que se observó una banda entre 3300 y 3600 cm-1 debido al estiramiento O – H / N – H en AuNP, AuNP + anticuerpos de detección y funcionalizadas. AuNP. Sin embargo, se observó un ensanchamiento de la misma banda en las AuNP funcionalizadas (Fig. 3), lo que sugiere la estabilización de las AuNP mediante la funcionalización al romper los enlaces O – H / N – H. De manera similar, los espectros FTIR de AuNP revelaron dos picos principales para el estiramiento de OH y C = O a 3307 y 1635 cm-1, respectivamente, mientras que se observó un pico medio a 1365 cm-1 (correspondiente a la vibración de estiramiento de CO)28. El mismo fenómeno también se documentó en espectros FTIR de AuNP acopladas con mAbs 'anti-HBsAg (antígeno de superficie de hepatitis B) de ratón'29, en los que el pico característico observado con AuNP no unidas a 3435 cm-1 (debido a las vibraciones de estiramiento del OH) desapareció cuando las AuNP fueron acoplados con anticuerpos de detección. Además, se observaron tres picos a 1650 cm-1/616 cm-1 y 3335 cm-1 debido a la deformación del N-H, así como a las vibraciones de estiramiento del N-H, respectivamente, validando así de forma cruzada el acoplamiento del sistema anti-HBsAg. ' mAbs con AuNPs29.

Simultáneamente, se utilizó AFM para evaluar la topografía de la superficie y la distribución de altura de AuNP, AuNP + anticuerpos de detección y AuNP funcionalizadas (Fig. 4), donde un aumento en la altura indicó la conjugación de anticuerpos de detección/oligonucleótidos con AuNP funcionalizadas. A diferencia de las AuNP no unidas, la AFM observó un aumento similar en la altura cuando las AuNP se conjugaron con albúmina sérica bovina (BSA)30,31. De manera similar, los espectros UV-vis de puntos cuánticos de fenilalanina-carbono (Phe-CQD), los nanomateriales biocompatibles no tóxicos, exhibieron dos picos de absorción a 250 y 340 nm, lo que implica la absorción característica del sistema π aromático32. Además, el AFM de los Phe-CQD reveló una topografía 3D con una altura media de 5 nm, mientras que el FTIR reveló amplias bandas de absorción entre 3100 y 3500 cm-1 debido a las vibraciones O – H y N – H32.

La conjugación de anticuerpos de captura con MB se confirmó mediante Magneto-ELISA y espectroscopía UV-vis (Figuras complementarias 3a, b); se utilizaron las mismas técnicas para confirmar el acoplamiento de anticuerpos de captura con MB en artículos anteriores15,17,24 . Posteriormente, determinamos un LOD de 1 fg / ml para Mtb LAM + MPT-64 purificado mediante MB-AuNP-I-PCR en tampón (Fig. 5a), así como EV en orina (de individuos sanos) enriquecidos con el antígeno purificado. y no demostró ningún efecto de matriz de muestra. De manera similar, se obtuvieron LOD de 1 fg/mL y 10 fg/mL sin ningún efecto de matriz de muestra para Mtb CFP-10+MPT-64 y ESAT-6 purificados, respectivamente, mediante MB-AuNP-I-PCR tanto en muestras de tampón como de saliva. enriquecido con antígeno purificado15,17. Sin embargo, tanto I-PCR como Magneto-ELISA en el presente estudio exhibieron un efecto de matriz de muestra, que fue evidente a partir de LOD más altos obtenidos en EV de orina (de individuos sanos) enriquecidos con LAM+MPT-64 purificado que el obtenido en tampón. Al mismo tiempo, la proteína p24 Gag del VIH-1 se detectó mediante MB-AuNP-RT-I-PCR con <200 células T CD4+/μL en plasma de hombres infectados por el VIH-133. También se ha detectado enterotoxina B estafilocócica hasta 269 fg/mL en varias muestras de alimentos mediante micropartículas magnéticas-AuNP-RT-I-PCR16.

Sorprendentemente, se detectaron células CD4+ hasta 50 células/μL en muestras de sangre de pacientes con SIDA mediante Magneto-ELISA34. A diferencia de los MB sintéticos utilizados para Magneto-ELISA y MB-AuNP-I-PCR en el presente estudio, Oh et al.35 emplearon nanoclusters de Fe3O4 recubiertos de sílice ("nanoperlas magnéticas") para diseñar un ensayo inmunoabsorbente ligado a nanozimas magnéticas que alcanzó un LOD de 100 pg/mL para detectar el virus de la influenza A. Por el contrario, se utilizaron magnetosomas biogénicos de Magnetospirillum gryphiswaldense en Magneto I-PCR para detectar el HBsAg purificado en sueros humanos con un LOD de 320 pg/ml36. Sin embargo, los magnetosomas biogénicos tienen algunas limitaciones debido a la tolerancia limitada a los detergentes y la menor estabilidad de sus membranas biológicas15,17.

Obtuvimos una alta sensibilidad (87,2%) y especificidad (97,1%) mediante MB-AuNP-I-PCR basada en la detección de LAM+MPT-64 en EVs en orina de 47 pacientes con GUTB en total y 35 controles sin TB, respectivamente con respecto a SRC (Tabla 1). Además, la sensibilidad alcanzada por MB-AuNP-I-PCR fue significativamente mayor (p <0,05–0,01) que la I-PCR (68,1%) y Magneto-ELISA (61,7%). También corroboramos nuestros resultados de MB-AuNP-I-PCR con el MB-AuNP-RT-I-PCR cuantitativo SYBR Green que mostró resultados casi equivalentes (85,7% de sensibilidad y 95% de especificidad) para diagnosticar pacientes clínicamente sospechosos de TBGU en vehículos eléctricos en orina ( Tabla 3). Al comparar la detección de LAM+MPT-64 en EV de orina de casos de GUTB mediante MB-AuNP-I-PCR en este estudio con la detección de CFP-10+MPT-64 mediante MB-AuNP-I-PCR en muestras de EPTB (pleural/ líquidos ascíticos, pus, etc.)15, la detección con LAM+MPT-64 reveló una mayor sensibilidad (87,2 vs. 78,1%) que esta última. Esto podría deberse a la detección de un cóctel de LAM+MPT-64, en el que LAM (en lugar de CFP-10) se considera un biomarcador más favorable para la detección de tuberculosis en orina/VE en orina14,37. Además, la concentración de LAM+MPT-64 probablemente aumentó en los EV de la orina de los casos de GUTB, en comparación con las muestras puras de EPTB utilizadas en un estudio anterior15. De manera similar, al comparar la detección de LAM+MPT-64 en EVs en orina de casos de GUTB mediante MB-AuNP-I-PCR con la detección de LAM en EVs en orina de casos totales de EPTB mediante I-PCR convencional, la detección de LAM+MPT-64 mostró mejor sensibilidad (87,2 vs. 67,9%) y especificidad (97,1 vs. 92,7%) que estos últimos14. Lo más probable es que esto se debiera a la detección de LAM+MPT-64 (en lugar de LAM solo) en los EV de orina, a la diferente naturaleza de las muestras (GUTB frente a EPTB total) en los dos estudios y, lo que es más importante, al uso de MB-AuNP-I- PCR, que es un método relativamente más preciso que la I-PCR para detectar biomarcadores en muestras clínicas15.

Es de destacar que hay dos poblaciones distintas de EV liberados de macrófagos infectados con Mtb, por ejemplo, los que encierran los marcadores de células EV del huésped (CD63/CD9) y los marcadores de Mtb, como los lipoglucanos (LAM) y las lipoproteínas (LpqH) que regulan tanto y respuestas inmunes adquiridas38,39. De manera similar, se demostró que los macrófagos THP-1 humano y J774 murino infectados con Mycobacterium bovis BCG liberan exosomas que contienen el complejo LAM, LpqH y Ag8540. Además, la liberación de EV micobacterianos (MEV) que contienen LAM/LpqH depende de la viabilidad de Mtb, lo que implica que la replicación activa de Mtb es esencial para la generación de MEV38,39, lo que sugiere que la detección de LAM/LpqH dentro de MEV puede indicar enfermedad de tuberculosis activa. Las respuestas humorales a los MEV (que contienen LAM) con sueros de pacientes con tuberculosis pulmonar VIH negativos también se documentaron mediante ELISA y técnicas de inmunotransferencia41. Comparable a la detección de LAM+MPT-64 en vehículos eléctricos en orina, se detectaron péptidos Mtb CFP-2 (Rv2376c), MPT-32 (Rv1860), MPT-64 y BfrB (Rv3841) dentro de los exosomas séricos de pacientes con tuberculosis mediante monitorización avanzada de reacciones múltiples. -espectrometría de masas (MRM-MS)42, aunque este método no es apropiado para diagnosticar la tuberculosis en entornos de campo. Además, MRM-MS43 detectó los péptidos Mtb GlnA1 (Rv2220), GarA (Rv1827), GroES (Rv3418c) y DnaK (Rv0350) dentro de los exosomas séricos de individuos con tuberculosis latente. También se ha documentado la identificación de vehículos eléctricos derivados de plaquetas circulantes mediante citometría de flujo en pacientes con COVID-1944.

Sorprendentemente, la mayor sensibilidad (87,2%) atribuida por MB-AuNP-I-PCR en este estudio también podría deberse a la amplificación dual, es decir, el uso de AuNP multivalentes que liberan múltiples señales de ADN por molécula de anticuerpo, mientras que la PCR imparte otro grado de sensibilidad. amplificación15. Además, la alta especificidad (97,1%) alcanzada por MB-AuNP-I-PCR probablemente se debió al lavado vigoroso y la eliminación de antígenos/anticuerpos no unidos en el sistema líquido mediante el uso de un campo magnético externo para suprimir el ruido de fondo y el efecto de matriz de muestra15,33 . Asimismo, Kim et al.33 mostraron una alta sensibilidad (99%) y especificidad (100%) mediante MB-AuNP-RT-I-PCR basada en la detección de la proteína p24 Gag en muestras de plasma de individuos infectados por VIH-1.

Nuestro SYBR Green MB-AuNP-RT-I-PCR cuantitativo también puede monitorear la dinámica de la enfermedad, ya que se detectó un rango dinámico de LAM+MPT-64 (400 fg/mL a 11 ng/mL) dentro de los EV urinarios de pacientes con GUTB ( Figura 6b). Tanto LAM como MPT-64 representan biomarcadores para la replicación activa de Mtb; sus niveles aumentados en orina/VEV urinarios pueden reflejar la progresión de la enfermedad GUTB activa5,14,39. Anteriormente demostramos concentraciones disminuidas de MPT-64+PstS1 (Rv0934) mediante RT-I-PCR en muestras clínicas de pacientes con tuberculosis pulmonar en tratamiento y probablemente la disminución de la carga bacteriana45. De manera similar, este trabajo se puede ampliar aún más para evaluar la regresión de la enfermedad mediante MB-AuNP-RT-I-PCR dentro de los EV urinarios de pacientes con GUTB que reciben ATT. Sin embargo, MB-AuNP-RT-I-PCR requiere costosos equipos de PCR en tiempo real y técnicos capacitados, mientras que MB-AuNP-I-PCR es comparativamente un método menos costoso que puede utilizarse para diagnosticar casos de GUTB de forma rutinaria.

Para concluir, desarrollamos un ensayo MB-AuNP-I-PCR (formato líquido) para detectar un cóctel de Mtb LAM+MPT-64 en EVs en orina de pacientes con GUTB, que demostró alta sensibilidad (~ 87%) y especificidad (~ 97%). %), en comparación con I-PCR y Magneto-ELISA. De hecho, la alta precisión diagnóstica adquirida por MB-AuNP-I-PCR superó la sensibilidad de las directrices de la OMS46 para perfiles de productos objetivo de alta prioridad (≥ 80% de sensibilidad y ≥ 98% de especificidad para el diagnóstico de EPTB, incluida GUTB) y casi igualó la especificidad. deliberar sobre una nueva prueba diagnóstica. Hasta donde sabemos, este es el primer informe que detecta LAM+MPT-64 en vehículos eléctricos en orina de casos de GUTB mediante MB-AuNP-I-PCR con resultados prometedores. Después de validar los datos de MB-AuNP-I-PCR con un tamaño de muestra más grande de diversos entornos epidemiológicos y reducir el costo, esta prueba puede traducirse en un kit de diagnóstico atractivo.

LAM purificado (NR-14848), MPT-64 (NR-44102), pAb anti-LAM de conejo (NR-13821) y pAb CDC1551 anti-Mtb de cobaya (NR-13818) se recibieron como generosos obsequios de BEI Resources, ATCC. , Manassas, VA, EE. UU., mientras que los pAb anti-MPT-64 de conejo se adquirieron en Abcam (Cambridge, Reino Unido). El 'reactivo de aislamiento de exosoma total' de la orina (n.º de catálogo 4484452) se adquirió de Thermo Fisher Scientific, mientras que los RoboStrips se adquirieron de AJ Roboscreen, Leipzig, Alemania. BSA, sulfo-SMCC [4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo] y 1,4-ditiotreitol (DTT) se adquirieron de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania).

Temprano en la mañana, se obtuvieron muestras de orina a mitad del chorro (~ 5 ml) de pacientes masculinos y femeninos con GUTB fuertemente sugestivos y de sujetos de control sin tuberculosis (mediante su consentimiento informado por escrito) en el hospital asociado con el Departamento de Urología/Obstetricia y Ginecología, UHS. , Rohtak. Esta propuesta fue aprobada por los Comités Institucionales de Ética Humana (IHEC) de la Universidad Maharshi Dayanand, Rohtak (IHEC/19/02 e IHEC/2021/306) y nuestra investigación se realizó según las pautas establecidas por la Declaración de Helsinki para participantes humanos. . Las muestras de orina se centrifugaron a 2000 xg durante 30 minutos a 4 °C para eliminar las células/desechos y los sobrenadantes se almacenaron a –20 ºC hasta su uso posterior.

Las muestras de orina de pacientes con GUTB (n = 47) se clasificaron en términos generales como: (i) Casos de GUTB confirmados (n = 7), que fueron positivos para AFB mediante baciloscopia mediante tinción de Ziehl-Neelsen, identificación por cultivo para Mtb en medio LJ o positivo GeneXpert5, (ii) Casos de GUTB clínicamente sospechosos (n = 40), todos con frotis negativo/cultivo negativo pero elegidos en función de las características clínicas, las imágenes, la PCR IS6110 y la respuesta a ATT. Además, (iii) controles no tuberculosos (n = 35) que comprendían pacientes con infección del tracto urinario de origen no tuberculoso (n = 11) e irregularidades menstruales (n = 24). Sin embargo, se excluyeron los pacientes que ya estaban recibiendo ATT y las personas con casos comprobados de tuberculosis multirresistente/extensamente resistente a los medicamentos en el momento de la recolección de muestras5. Además, se excluyeron las personas con síntomas sugestivos de tuberculosis pulmonar y otros tipos de EPTB, pero no de GUTB, las personas coinfectadas por VIH, los pacientes diabéticos/con cáncer y las personas que no respondían a ATT después de ocho semanas de terapia. En la figura se muestra el diagrama de flujo de los participantes del estudio divididos en diferentes grupos para evaluar las EV en orina de casos de GUTB y controles sin tuberculosis para la detección de LAM+MPT-64 mediante MB-AuNP-I-PCR/I-PCR y Magneto-ELISA. 7a.

(a) Diagrama de flujo para agrupar a los participantes del estudio (pacientes con GUTB/controles sin tuberculosis) evaluados para la detección de LAM+MPT-64 mediante MB-AuNP-I-PCR/I-PCR y Magneto-ELISA. (b) Diagrama de flujo para agrupar a los participantes del estudio (pacientes con GUTB/controles sin tuberculosis) evaluados para la detección de LAM+MPT-64 mediante SYBR Green MB-AuNP-RT-I-PCR y Magneto-ELISA.

Además, se eligieron al azar 41 pacientes (21 casos clínicamente sospechosos de TB GUTB y 20 controles sin TB) y se analizaron sus EV en orina para la detección de LAM+MPT-64 utilizando un SYBR Green MB-AuNP-RT-I-PCR cuantitativo y Magneto- ELISA (Figura 7b).

Los sobrenadantes de orina de casos de GUTB/controles sin TB se sacaron del refrigerador y se llevaron a temperatura ambiente. Se mezclaron volúmenes iguales de sobrenadantes de orina y "reactivo de aislamiento de exosomas total" hasta que la solución se volvió homogénea14. Las mezclas de reacción se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h, seguido de una centrifugación a 10.000 x ga 4 °C durante 1 h. Los vehículos eléctricos presentes en los gránulos se resuspendieron en 50 µl de PBS estéril.

El contenido de proteínas de los vehículos eléctricos se determinó tomando la absorbancia a 280 nm con un espectrofotómetro Nanodrop TM 2000. El tamaño de partícula/recuento de vehículos eléctricos en orina se determinó mediante Nanosight NS300 NTA (Malvern Panalytical Application Lab, Nueva Delhi). El tamaño y la forma de los vehículos eléctricos urinarios también se analizaron utilizando Talos F200X TEM (Thermo Fischer; Sophisticated Analytical Instrumentation Facility, All India Institute of Medical Sciences, Nueva Delhi), en el que se dejaron caer 2 μl de vehículos eléctricos recién preparados sobre una rejilla recubierta de carbono y se ventilaron. seco. Esas rejillas se tiñeron con una solución de ácido fosfotúngstico al 2% y posteriormente se secaron antes de obtener imágenes.

El ADN indicador biotinilado se preparó mediante amplificación por PCR del gen bla del ADN plasmídico pUC19 utilizando el cebador directo 5'-biotina-GTCGTTTGGTATGGCTTC-3' y el cebador inverso 5'-CCTTCCTGTTTTTGCTCAC-3' y el producto amplificado se purificó mediante un kit de extracción en gel5 y se almacenó. a 4 °C hasta su uso posterior.

Se detectó un cóctel de LAM+MPT-64 mediante I-PCR como lo detallan Kamra et al.5 con pequeñas modificaciones. Los pocillos de RoboStrip se recubrieron con 50 μL de EV de orina óptimamente diluida (que contiene 200 μg/mL de proteína) en el tampón de recubrimiento (tampón de carbonato 0,05 M, pH 9,6), lo que se tradujo en 8,4 × 1011–11,5 × 1011 partículas/mL con un tamaño medio de partícula ± DE de 203 ± 81,8 a 220,4 ± 84 nm. Para determinar el LOD del LAM+MPT-64 purificado, se prepararon diluciones seriadas diez veces [de 1 µg/ml a 10 attogramos (ag)/ml] en el tampón de recubrimiento y se recubrieron pocillos RoboStrip con 50 µL de diferentes diluyentes. Todos los EV urinarios de casos de GUTB/sujetos de control sin TB se analizaron por triplicado para garantizar la reproducibilidad de los resultados. Las RoboStrips se incubaron durante la noche a 4 ° C y luego se lavaron con PBS que contenía Tween-20 al 0,05 % (PBST, tampón de lavado) a temperatura ambiente durante 1 min con agitación orbital (400–500 rpm). A continuación, los pocillos de RoboStrip se bloquearon con un tampón de bloqueo (BSA al 3 % en PBST) a 37 °C durante 2 h, seguido del lavado y la adición de 50 µl de anti-LAM de conejo (1:500)+anti-MPT-64 ( 1:1000)' pAbs. El resto de los pasos fueron los mismos que se describen en un artículo anterior5.

Las AuNP (~ 20 nm) se sintetizaron mediante reducción química15. Para validar la preparación de AuNP, la solución coloidal se escaneó entre 400 y 700 nm en espectroscopia UV-vis (UV-1800) y se registró la DO. El tamaño y la forma de las AuNP se analizaron utilizando un TEM de 200 kV, mientras que el recuento de partículas en las AuNP se determinó mediante la técnica NTA. Para el análisis TEM, las muestras se prepararon colocando unas gotas de AuNP en la rejilla y posteriormente se secaron antes de obtener imágenes.

Brevemente, se activaron, desalinizaron y purificaron los enlaces disulfuro de una solución 1 nM de 100 μL de ADN tiolado (5′-[C6Thiol] TTTTTTTTTTTTTTTGCTTGTCTCGTAAGTTGAGATTTCGCTATGCACGGTCCTT-3') utilizando filtros centrífugos según las instrucciones del fabricante17 y se almacenaron a -20 °C hasta su uso posterior. .

Brevemente, se mezclaron 500 μL de AuNP (4 × 109 partículas/mL) con 500 μL de pAb 'anti-LAM de conejo (1:500) + anti-MPT-64 (1:1000)' (1:1, v/ v) y se incubó a temperatura ambiente durante 45 min en una coctelera danzante15. A esto, se le agregaron 100 μL de ADN de captura activado y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min, seguido de la adición de Tween-20 al 10%, 2 M. NaCl (en PBS), así como BSA al 10%, y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. El exceso de ADN de captura se eliminó mediante centrifugación en frío a 12.000 rpm durante 15 min y las partículas se resuspendieron en 500 μL de PBS. A continuación, se agregaron 5 pM de ADN señal (5′-CTGCGACGATCTACCATCGACGTACCAGGTCGGTTGAAGGACCGTGCATAGCGAAATCTAACTTACGAGACAAGC-3') al residuo seguido de incubación a 37 °C durante 1 h para la hibridación, mientras que el resto de los pasos fueron los mismos que se detallan en un artículo anterior15. Las AuNP funcionalizadas se resuspendieron en PBS y se almacenaron a 4 °C hasta su uso posterior17. NTA encontró que el recuento de partículas en las AuNP funcionalizadas era de 2 × 109 partículas / ml.

Para determinar el número de moléculas de ADN señal unidas por AuNP, se prepararon AuNP funcionalizadas usando moléculas de ADN señal FAM26, y el resto de los pasos fueron idénticos para preparar AuNP funcionalizadas usando ADN señal no marcado15. Las moléculas de ADN de señal FAM no hibridadas se eliminaron mediante centrifugación a 12.000 rpm durante 15 minutos, mientras que las moléculas de ADN de señal FAM unidas con AuNP funcionalizadas se deshibridaron calentando a 95 ° C durante 15 minutos. La concentración de los oligonucleótidos liberados se determinó mediante espectrofotómetro de fluorescencia (Perkin Elmer Spectrofluorimeter LS 55, Singapur) con longitudes de onda de excitación y emisión de 485 y 528 nm, respectivamente, e interpolación de una curva de calibración lineal estándar (Fig. 2) trazada entre la intensidad de fluorescencia. frente a diferentes concentraciones de ADN de señal FAM (de 0,5 a 2 fmol/μL). Notablemente, el ADN de la señal FAM deshibridado de las AuNP funcionalizadas se diluyó 1:400 (en PBS) antes del análisis. El número promedio de moléculas de ADN señal unidas por AuNP se determinó dividiendo la concentración molar de ADN señal por la concentración de AuNP en las AuNP funcionalizadas.

Las AuNP funcionalizadas se caracterizaron mediante el seguimiento de un cambio en el pico de absorbancia máxima17 con espectroscopia UV-vis. Para validar la conjugación de pAb 'anti-LAM de conejo + anti-MPT-64' con AuNP en las AuNP funcionalizadas, se empleó ELISA indirecto23. Además, para confirmar el acoplamiento del ADN señal a las AuNP funcionalizadas, se empleó PCR utilizando cebadores directos (5′-CTGCGACGATCTACCAT-3') e inversos (5′-GCTTGTCTCGTA AGTTGA-3')23.

La presencia de grupos funcionales específicos en AuNP, AuNP + anticuerpos de detección y AuNP funcionalizadas (conjugadas con anticuerpos/oligonucleótidos de detección) también se confirmaron registrando los espectros FTIR con el espectrómetro FTIR Varian 7000 entre 650 y 4000 cm-132. Además, el mapeo de superficie de AuNP, AuNP + anticuerpos de detección y AuNP funcionalizadas se llevó a cabo utilizando AFM (WITec Instrument, GmbH, Alemania), en el que las muestras se prepararon dejándolas caer sobre un sustrato de mica y se secaron a 37 °C32.

La activación de MB mediante sulfo-SMCC y la reducción de anticuerpos mediante DTT se realizaron simultáneamente como se describió anteriormente17. Posteriormente, los MB se resuspendieron en 500 μl de PBS y se mantuvieron a 4 ° C hasta su uso posterior. El acoplamiento de los anticuerpos de captura con MB se confirmó tomando OD a 270 nm y 405 nm con espectroscopia UV-vis y Magneto-ELISA, respectivamente15,17.

Primero, los LOD del LAM + MPT-64 purificado se determinaron mediante MB-AuNP-I-PCR, SYBR Green MB-AuNP-RT-I-PCR y Magneto-ELISA. Para ello, se prepararon diluciones seriadas diez veces de antígeno (de 1 µg/ml a 10 ag/ml en PBS) para MB-AuNP-I-PCR, mientras que los rangos fueron de 10 ng/ml a 100 fg/ mL y 1 µg/mL a 1 pg/mL para SYBR Green MB-AuNP-RT-I-PCR y Magneto-ELISA, respectivamente. Posteriormente, se tomaron 50 µL de MB acoplados con pAb anti-Mtb de cobaya (1:1000) en tubos eppendorf, seguido de lavado con 'tampón de lavado' (usando un campo magnético externo) y adición de 200 µL de tampón de bloqueo (5 % BSA en PBS). Después de un lavado minucioso, se agregaron 50 µl de diferentes diluyentes de LAM+MPT-64 purificado o EV de orina óptimamente diluidos (que contienen 200 µg/ml de proteína) de pacientes con GUTB/controles sin tuberculosis. Todas las muestras clínicas se analizaron por triplicado para MB-AuNP-I-PCR (y el Magneto-ELISA correspondiente) y por duplicado para SYBR Green MB-AuNP-RT-I-PCR (y el Magneto-ELISA correspondiente). Las mezclas de reacción se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h con agitación constante para evitar la sedimentación de los MB. Los MB se lavaron minuciosamente con "tampón de lavado" y se agregaron 50 µl de AuNP funcionalizadas. Las mezclas de reacción se incubaron nuevamente a temperatura ambiente durante 1 h con agitación constante seguida de lavado, las cuales se resuspendieron en 100 µL de agua destilada y se calentaron a 95 °C durante 15 min. Después de enfriar a temperatura ambiente, se aplicó un campo magnético externo y se tomaron 10 µL de sobrenadante para evaluar la señal de ADN liberada mediante PCR17.

Para MB-AuNP-RT-I-PCR, todos los pasos fueron los mismos que para MB-AuNP-I-PCR, excepto que se empleó PCR en tiempo real (en lugar de PCR) en el extremo terminal y USB® VerQuest™ SYBR® Green. Se utilizó qPCR Mastermix según las instrucciones del fabricante5. Además, se incluyeron el control de fondo y el control negativo (NC), que contenían todos los componentes excepto "sin ADN informador" y "sin LAM+MPT-64", respectivamente. El resto de los pasos fueron los mismos que se describen en un estudio anterior5. Para Magneto-ELISA, todos los pasos iniciales fueron como MB-AuNP-I-PCR pero en lugar de agregar AuNP funcionalizadas, pAbs 'conejo anti-LAM (1:500)+anti-MPT-64 (1:1000)' y cabra Se añadió consecutivamente fosfatasa alcalina anti-IgG de conejo (1:1000) después de un lavado minucioso en cada paso utilizando un campo magnético externo. Posteriormente se siguieron todos los pasos tal y como se detalla en un trabajo anterior17.

Para determinar el efecto de la matriz de la muestra mediante MB-AuNP-I-PCR, MB-AuNP-RT-I-PCR, I-PCR y Magneto-ELISA, se realizaron pruebas previas de EV en orina de individuos sanos en varias diluciones para detectar la ausencia de LAM/ A MPT-64 se le añadió LAM+MPT-64 purificado (1 μg/ml) y los LOD se determinaron preparando diluciones seriadas diez veces del mismo15,16.

La DO media de las muestras clínicas del grupo de control+2SD se utilizó como valor de corte para los casos positivos de GUTB mediante Magneto-ELISA17, mientras que el LOD para LAM+MPT-64 mediante MB-AuNP-RT-I-PCR se calculó mediante NC+ 3SD5. Mientras tanto, la presencia o ausencia de una banda específica indica la presencia/ausencia de antígeno para I-PCR (470 pb) y MB-AuNP-I-PCR (76 pb)14,15. La sensibilidad y especificidad de MB-AuNP-I-PCR, I-PCR y Magneto-ELISA se determinaron con un IC del 95 %, frente a CRS como estándar de referencia5. La comparación de MB-AuNP-I-PCR versus I-PCR/Magneto-ELISA se realizó mediante la prueba de simetría exacta, mientras que las comparaciones de las DO entre los diferentes grupos se realizaron mediante la prueba t de 2 muestras con varianzas iguales15. Para los análisis se utilizó el software estadístico STATA/SE versión 14.2. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en los archivos de información complementaria.

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PKM y BD reconocen al Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR) de Nueva Delhi por otorgar la beca de científico emérito e investigador asociado, mientras que EK reconoce al CSIR por otorgar la beca de investigación junior/senior. AR reconoce al Consejo Indio de Investigación Médica de Nueva Delhi por la concesión de la beca de investigación senior. Agradecemos a Meenakshi Chauhan y Devendra S Pawar, UHS, Rohtak por proporcionarnos muestras clínicas de pacientes con GUTB y controles sin tuberculosis.

Centro de Biotecnología, Universidad Maharshi Dayanand, Rohtak, 124001, India

Ekta Kamra, Bhawna Dahiya, Aishwarya Soni y Promod K. Mehta

Centro especial de nanociencia e instalación de investigación de instrumentación avanzada, Universidad Jawaharlal Nehru, Nueva Delhi, 110067, India

Tulika Prasad y Anam Rais

Departamento de Estadística, Ramanujan College, Universidad de Delhi, Nueva Delhi, 110019, India

Abhishek Sheoran

Departamento de Biotecnología, Universidad de Ciencia y Tecnología Deenbandhu Chhotu Ram, Murthal, Sonipat, 131039, India

Aishwarya Soni

Departamento de Microbiología, Universidad de Ciencias de la Salud (UHS), Rohtak, 124001, India

Suman Sharma

Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias de la Salud Afines, Universidad SGT, Gurgaon, 122505, India

Ascendió a K. Mehta

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EK, PKM y TP llevaron a cabo la mayoría de los experimentos, participaron en el análisis de datos y la preparación del manuscrito. AR, BD, Ai.S. y SS llevaron a cabo algunos experimentos. TP, Ab.S., EK, AR y PKM participaron en el análisis de datos. PKM concibió el estudio y diseñó los experimentos, mientras que EK y PKM prepararon el borrador final del manuscrito. Todos los autores leyeron el manuscrito, participaron en la edición del manuscrito y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Promod K. Mehta.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Kamra, E., Prasad, T., Rais, A. et al. Diagnóstico de tuberculosis genitourinaria: detección de lipoarabinomanano micobacteriano y biomarcadores MPT-64 dentro de vesículas extracelulares de orina mediante un ensayo de inmuno-PCR basado en nanopartículas. Informe científico 13, 11560 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38740-3

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Recibido: 29 de marzo de 2023

Aceptado: 13 de julio de 2023

Publicado: 18 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38740-3

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